病毒灭活是指用物理或化学手段杀死病毒,但是不损害它们体内有用抗原的方法。灭活病毒,会使病容毒蛋白的结构受到破坏,蛋白不再有生理活性,所以失去感染,致病和繁殖能力,但是常规的灭活不影响病毒蛋白的一级结构,意思就是病毒蛋白的序列没有变化。*系统对抗原的识别分成两种,一种是构像表位,一种是线性表位。构象表位意思就是蛋白的三维结构,而线性表位就是蛋白的序列一级结构。T细胞只需要识别线性表位就成接受*呈递细胞给出的信号,引发*反应。所以灭活的病毒具有抗原性,但失去感染力。这个其实是很多疫苗的制造原理。灭活的病毒失去感染活性,但仍有融合活性。用于动物细胞工程中的细胞融合的诱导剂。
病毒灭活的机理有三:
1、破坏包膜:包膜含有脂类物质,因之有包膜的病毒可迅速被脂溶剂破坏,如、氯仿或去氧胆酸钠可使病毒灭活。实际上可利用病毒对脂溶剂的敏感性来检查病毒是否有包膜。物理因子,如渗透压改变、冻融、热和干燥等都可引起包膜破坏。一般认为,呼吸道感染的病毒对于燥抵抗力弱,传播主要是人间直接感染,这是因为有包膜的原故。
2、病毒蛋白质变性:能使蛋白质变性的化学制剂都能使病毒灭活,如酚、、次氯化物、酸和碱等。加热引起变性也是有效灭活的方法。一般说病毒对热抵抗力弱,60°C几分钟就使之感染性明显降低,因此在分离病毒时,从患者取来的标本需低温保存,迅速送往实验室,长期保存置于-80°C以下的低温条件。
3、病毒核酸的损害:、y线等电离可切断核酸,紫外线可使核苷酸链上相邻的嘧啶碱基形成二聚物,而破坏病毒基因的功能。另外吖啶橙或中性红等染料可与病毒核酸结合,暴露于光线之下,可使核酸分解,而使病莓灭活。
病毒灭活试验病毒悬液的制备:
1、从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞,在37°C温水中迅速融化,用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内,吹吸数次,使混匀,立即离心(3000r/min, 3min) ,去上清液。再加入适当的细胞维持液,吹吸数次,使混匀,同上离心后,转种于加有10完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况,在细胞长满单层时,用于消毒试验。
2、取出低温冻存的试验病毒毒种,37°C水浴融化,用细胞维持液作10倍稀释,然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内,置37°C温箱中,使与细胞吸附、生长。逐日观察病变,待3/4细胞出现病变时,收获病毒。
3、将含有病毒及宿主细胞的培养液,在冰浴条件下,用超声波(或反复冻融)破碎宿主细胞,释放病毒。然后,尽快离心(6000r/min,15min)去除沉淀(主要为细胞碎片),上清液即为所需的病毒悬液。按每管1. 0分装于无菌离心管(1.5)中。
4、取1支病毒悬液,按病毒滴度测定法,测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80°C备用。
病毒灭活试验适用范围:主要适用于消毒产品或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术,评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验,只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
病毒灭活试验器材:
1、试验用病毒株:脊髓灰质炎病毒1型(poliovirus- I,PV- I );疫苗株;艾滋病病毒1型(HIV-1)美国株。
2、宿主细胞:可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL、细胞系,作为PV-1的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒1型(human T cell leukemiavirus 1, HTLV-1)基因的人淋巴细胞(株)作为HIV-1的测试细胞。
3、细胞培养瓶与96孔培养板。
4、恒温水浴箱。
5、二氧化碳培养箱。
6、层流**净工作台。
7、低温冰箱(-20°C, -80°C)。
8、液氮罐。
9、倒置显微镜。
10、离心机。
11、可调移液器及配套一 次性塑料吸头。
12、细胞维持培养基。
13、细胞完全培养基。
14、去离子水。
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